UJI SEROLOGIS KHUSUS ELISA

ELISA ( Enzyme-linked immunosorbent assay) atau 'penetapan kadar imunosorben taut-enzim' merupakan uji serologis yang umum digunakan di berbagai laboratorium imunologi. Uji ini memiliki beberapa keunggulan seperti teknik pengerjaan yang relatif sederhana, ekonomis, dan memiliki sensitivitas yang cukup tinggi. ELISA diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall untuk menganalisis adanya interaksi antigen dengan antibodi di dalam suatu sampel dengan menggunakan enzim sebagai pelapor (reporter label).

Umumnya ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu competitive assay yang menggunakan konjugat antigen–enzim atau konjugat antobodi–enzim, dan non-competitive assay yang menggunakan dua antibodi. Pada ELISA non-competitive assay, antibodi kedua akan dikonjugasikan dengan enzim sebagai indikator. Teknik kedua ini seringkali disebut sebagai "Sandwich" ELISA.

Uji ini dilakukan pada plate 96-well berbahan polistirena. Untuk melakukan teknik "Sandwich" ELISA ini, diperlukan beberapa tahap yang meliputi:

1. Well dilapisi atau ditempeli antigen.
2. Sampel (antibodi) yang ingin diuji ditambahkan.
3. Ditambahkan antibodi kedua yang dikonjugasikan dengan enzim tertentu seperti peroksidase alkali. Antibodi kedua ini akan menempel pada antibodi sampel sebelumnya.
4. Dimasukkan substrat enzim yang dapat menimbulkan warna tertentu saat bereaksi.
5. Intensitas warna campuran diukur dengan spektrofotometer yang disebut ELISA reader hingga mendapatkan hasil berupa densitas optis (OD). Dengan menghitung rata-rata kontrol negatif yang digunakan, didapatkan nilai cut-off untuk menentukan hasil positif-negatif suatu sampel. Hasil OD yang berada di bawah nilai cut-off merupakan hasil negatif, dan demikian juga sebaliknya. 

Uji ini memiliki beberapa kerugian, salah satu di antaranya adalah kemungkinan yang besar terjadinya hasil false positive karena adanya reaksi silang antara antigen yang satu dengan antigen lain. Hasil berupa false negative dapat terjadi apabila uji ini dilakukan pada window period, yaitu waktu pembentukan antibodi terhadap suatu virus baru dimulai sehingga jumlah antibodi tersebut masih sedikit dan kemungkinan tidak dapat terdeteksi

1. Pengujian Secara Serologi (ELISA)       

1.1 Secara langsung (baku) (Double Antibody Sandwich) (DAS ELISA)      

Dalam uji ini digunakan konjugat gamma globulin murni dari antibody virus yang telah dilabel dengan enzim. Konjugat ini hanya dapat digunakan untuk virus tertentu saja.            

Cara kerja

• Gamma globulin (pengenceran yang telah disiapkan) dimasukkan ke dalam sumur-sumur cawan elisa, masing-masing sebanyak 100-200 ul.
• Selanjutnya diinkubasikan selama 1 – 2 jam pada suhu 37oC, lalu buang larutannya dan cawan ELISA dibilas dengan PBST sebanyak 3 kali, masing-masing 3 menit.
• Contoh antigen (dilarutkan dalam PBST + PVP atau ekstrak buffer) dimasukkan ke dalam sumur-sumur cawan ELISA, masing-masing 100 – 200 ul.
• Inkubasikan selama 1 – 2 jam pada suhu 37oC. Lalu buang larutannya dan cawan Elisa dibilas kembali dengan PBST sebanyak 3 kali, masing-masing selama 3 menit.
• Enzim konjugat yang telah dlarutkan dengan konjugat buffer dengan perbandingan tertantu dimasukkan dalam lubang-lubang cawan masing-masing sebanyak 100 – 200 ul.
• Inkubasikan selama 1 – 2 jam pada suhu 37oC. Lalu buang larutannya dan cawan Elisa dibilas kembali dengan PBST sebanyak 3 kali, masing-masing selama 3 menit.
• Siapkan substrat buffer kemudian larutkan PNPP ke dalamnya dengan perbandingan 1:1 (ul/ml), masukkan larutan tadi kedalam lubang-lubang cawan Elisa sebanyak 150 – 200 ul. Inkubasikan cawan Elisa pada suhu kamar. Lihat perubahan warnanya setelah 30 – 60 menit. Pembacaan dapat dilakukan secara langsung (visual) atau dengan Elisa Reader.               

1.2 Secara tidak langsung (Double Antigen Coating/DAC)

Cara pengujian tidak langsung digunakan konjugat gamma globulin dari serum darah hewan(kelinci, kambing atau mencit) yang telah dilabel dengan enzim. Konjugat ini dapat digunakan untuk mendeteksi semua virus tanaman.

Cara Kerja :

• Sap antigen dilarutkan dalam coating buffer dengan perbandingan 1:50 atau lebih
• Larutan tersebut dimasukkan ke dalam lubang-lubang cawan Elisa, masing-masing sebanyak 100 ul.
• inkubasikan selama 1 jam pada suhu 37oC, lalu buanglah larutannya dan cawan Elisa dibilas dengan PBS-Tween sebanyak 3 kali, masing-masing selama 3 menit.
• Antiserum (dilarutkan dalam konjugat buffer) dimasukkan ke dalam lubang-lubang cawan Elisa, masing-masing sebanyak 100 ul.
• Inkubasikan selama 1 jam pada suhu 37oC. Lalu lakukanlah tahap kerja ke-2
• Konjugat (anti rabbit FC gamma globulin + alkalin phospatase) dimasukkan masing-masing sebanyak 100 ul.
• Inkubasikan selama 1 jam pada suhu 37oC, lalu lakukan tahap kerja ke-2.
• Substrat (sama seperti pada uji Elisa baku) dimasukkan ke dalam lubang-lubang cawan Elisa, masing-masing sebanyak 100 ul.
• inkubasikan cawan Elisa pada suhu kamar selama 15 – 30 menit. Pembacaan dapat langsung (warna kuning yang timbul) atau dengan menggunakan ELISA Reade

Aplikasi ELISA

ELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodI dalam suatu sampel, karenanya merupakan metode yang sangat berguna untuk mendeterminasi konsentrasi  antibodi  dalam serum (seperti dalam tes HIV), dan juga untuk mendeteksi kehadiran antigen. Metode ini juga bisa diaplikasikan dalam indiustri makanan untuk mendeteksi allergen potensial dalam makanan seperti susu, kacang, walnut, almond, dan telur. ELISA  juga dapat digunakan dalam bidang toksikologi untuk uji pendugaan cepat pada berbagai kelas obat.

Beberapa Tipe ELISA

A. Indirect ELISA

Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk mendeterminasi konsentrasi antibodi dalam serum adalah:

1. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar  yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji.

2. Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin (BSA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter.  Tahap ini dikenal sebagai blocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate.

3. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.

4. Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking.

5. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim.

6. Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat.

7. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia.

8. Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/ elektrokimia lainnya.

Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat enzim yang tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama dari metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada permukaan lubang. Mekanisme indirect ELISA dapat dilihat pada gambar di bawah ini.

2. Sandwich ELISA

Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:

1. Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi ‘penangkap’
2. Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir
3. Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate
4. Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat
5. Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan  antigen
6. Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan dengan antibodi primer
7. Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuang
8. Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/ berfluoresensi/ elektrokimia
9. Diukur absorbansinya  untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen

Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya menguji sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk protein serum) dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang terimobilisasi. Prinsip kerja sandwich ELISA dapat dilihat pada skema berikut ini:

3. ELISA kompetitif

Tahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah dibahas sebelumnya, yaitu:

1. Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya
2. Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi antigen
3. Plate dicuci, sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam sampel, semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan lubang, karena inilah disebut kompetisi
4. Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer. Antibodi sekunder ini berpasangan dengan enzim
5. Substrat ditambahkan, enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik/ fluoresensi.

Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin lemah sinyal yang dihasilkan. Prinsip kerjanya dapat dilihat pada gambar berikut ini: